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恒遠(yuǎn):TA克隆常見問題分析

閱讀次數(shù)：1330 發(fā)布時間：2012/9/3 9:32:51

現(xiàn)象可能原因解決方案轉(zhuǎn)化后無菌落生長感受態(tài)細(xì)胞已經(jīng)失效用pUC18質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化，確認(rèn)細(xì)胞的感受態(tài)效率。1ng pUC18質(zhì)粒至少應(yīng)得到1000個以上的轉(zhuǎn)化子。如有問題，重新制備感受態(tài)細(xì)胞。平板所用抗性不對pBS-T載體為amp抗性，工作濃度 100 ug/ml 連接中使用了不恰當(dāng)?shù)膙ector:ｉnsert 比例估計PCR產(chǎn)物的量，將vector:insert比例限制在3:1到 1:5的范圍內(nèi)。對于極小的PCR產(chǎn)物進行克隆，很可能因為PCR產(chǎn)物嚴(yán)重過量，導(dǎo)致無菌落或菌落極少。白色克隆無插入片段可能反復(fù)凍融導(dǎo)致載體單個的3’端突出的T已經(jīng)降解試用其他批次的T載體。長期不用的載體請在-20℃保存，避免反復(fù)凍融載體。做自連對照檢測T載體。如果自連長出大量菌落，請放棄載體。轉(zhuǎn)化后只有白色克隆本載體加T及連接PCR產(chǎn)物效率非常高，對于一些質(zhì)量很好的PCR產(chǎn)物，有可能轉(zhuǎn)化后菌落全部為白斑平板上未涂 IPTG 或X-Gal如果平板上與空白對照相比，菌落數(shù)明顯增加，則該情況很正常。絕大部分菌落為藍(lán)色或淡藍(lán)色，只有極少數(shù)的白斑有可能插入片段沒有失活lacZ基因很小的插入片段（<500bp）不一定完全將lacZ基因失活，導(dǎo)致菌斑部分藍(lán)色。如果平板長的菌落很多，而自連對照長的菌落很少，藍(lán)色菌落中就包含有插入片段。挑選一些藍(lán)色菌落提質(zhì)粒進行酶切鑒定。正常大小的藍(lán)色或白色菌落周圍有一些很小的白色菌落這些小的白色克隆為amp敏感的衛(wèi)星菌落，它們不包含質(zhì)粒。不要挑取這些很小的白色菌落。確認(rèn)amp的濃度，并且平板37℃培養(yǎng)的時間不要過長。挑菌時不要挑取這些小的白色菌落。白色菌落在液體培養(yǎng)基中不長白色菌落為amp敏感的衛(wèi)星菌落確認(rèn)挑選大的白色菌落，確認(rèn)amp的有效性。

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